不同血清浓度及培养时间对成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.07.016

摘要/Abstract

摘要：

背景：课题组前期实验曾报道血清及神经生长因子对嗅鞘细胞体外增殖的影响，但对于嗅鞘细胞体外培养的血清浓度的选择及培养时间的掌握，这一方面的实验研究却报道较少
目的：通过研究不同血清浓度及体外培养时间对来源于成年大鼠嗅黏膜的嗅鞘细胞生长曲线的影响，从而了解不同实验条件对嗅鞘细胞体外生存和生长情况的影响。
方法：取成年大鼠嗅黏膜，进行体外分离培养，鉴定嗅鞘细胞，并用磺基罗丹明B酶标仪法测量各孔的吸光值(A值)，转化为嗅黏膜嗅鞘细胞的生长曲线。
结果与结论：血清浓度0%组的A值明显低于其他浓度组。血清浓度10%-90%组细胞均可以正常生长。特别是血清浓度在10%-40%，对细胞生长起到明显的促进作用。随着细胞生长时间的延长，血清浓度0%组A值呈微弱的降低，其余各浓度组A值呈现增加状态。开始几天的A值增加趋势较弱，第9天之后增加趋势明显增强。血清浓度10%-40%组，在第13天，细胞生长迅速增快，第19天左右进入平台期，第23天A值有减弱的趋势。而血清浓度在50%-90%组，在第13天细胞生长达到峰值，随着时间的延长，A值逐渐变小。说明不同血清浓度及不同培养时间等体外培养环境对大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞生长和生存有明显影响，因而利用血清进行体外细胞培养时应充分考虑所添加血清的浓度以及细胞培养的时间。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 嗅鞘细胞, 干细胞, 血清浓度, 细胞培养, 细胞生长曲线, 嗅黏膜

Abstract:

BACKGROUND: Preliminary experiments have reported the influence of serum and nerve growth factor on olfactory ensheathing cells proliferation in vitro, but there are less studies concerning choice of serum concentration and growth time for in vitro culture of olfactory ensheathing cells.
OBJECTIVE: To find out the influence of different blood serum concentration and growth time on olfactory ensheathing cells from the olfactory mucosa of adult rats based on the growth curve of olfactory ensheathing cells.
METHODS: The olfactory ensheathing cells from the olfactory mucosa of adult rats were separated, culture and identified in vitro. Sulforhodamine B and microplate reader were employed to measure absorbance values and plot growth curve of olfactory ensheathing cells.
RESULTS AND CONCLUSION: When cultured for the same time in blood serum of different concentrations, absorbance values, especially in the groups 10%, 20%, 30%, 40%, tended to increase with time except the 0% group. When cultured in the same serum for different time, absorbance values increased within the first 9 days, then promoted rapidly in the groups 10%, 20%, 30%, 40% at 13 days, entered the plateau phase at 19 days, and decreased at 23 days; meanwhile, in the other groups (50%, 60%, 70%, 80%, 90%) the absorbance values peaked at the 13th day and then decreased gradually. These findings indicate that different serum concentrations and different growth time in vitro affect cell growth and survival of olfactory ensheathing cells significantly, which should be fully considered when cells are cultured in an in vitro condition.

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Key words: olfactory mucosa, cells, microglia, growth charts, actihaemyl, nerve growth factor

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 1

2.1 供体动物的术后存活情况 动物经手术取出部分嗅黏膜后，一两天内呼吸频率加快，鼻腔内有少量血性分泌物，活动及饮食正常。手术切口于1周内愈合，术后2只SD大鼠均能长期存活。

2.2 嗅鞘细胞的形态学观察及免疫荧光染色 培养的嗅黏膜细胞由不同形态的细胞所组成。动态观察发现这些细胞刚贴壁时为纺锤形，从胞体向外周伸出许多丝状伪足，相邻细胞的丝状伪足相互吸引。经三四次传代培养后细胞大多为长梭形，突起细长，数量多，并成为优势细胞，见图1。经嗅鞘细胞特异性免疫细胞化学和免疫荧光染色证实，大部分双极或梭形细胞呈GFAP和NGFPRp75免疫反应阳性为嗅鞘细胞(图1A-C)。

2.3 磺基罗丹明B法测定细胞生长曲线^[10] 血清浓度对细胞生长影响的实验结果：血清浓度0%组的A值明显低于其他浓度组，血清浓度10%-90%组细胞均可以正常生长。随着血清浓度的增加，特别是血清浓度在10%-40%，对细胞生长起到明显的促进作用(相对于0%组，P=0.000)。当血清浓度继续增大，达到50%-90%时，对细胞生长仍有一定的促进作用(相对于0%组，P < 0.05)，只是对细胞生长促进的作用较血清浓度在10%到40%组明显变弱(P=0.000，图1D)。

生长时间对细胞生长影响的实验结果：随着细胞生长时间的延长，除0%组A值只呈微弱的降低趋势外，其余浓度组A值呈现增加状态。各浓度组A值在5天开始增加。生长时间在5-9 d时，A值增加趋势较弱，第9天之后，增加趋势又有所增强。血清浓度10%-40%组，在第13天，细胞生长迅速增快，第19天左右进入一个平台期，在第23天，A值有减弱的趋势。而血清浓度50%-90%组，在第13天，细胞生长似乎达到了峰值，其后随着时间的延长，A值逐渐变小(图1E)。

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引言

材料方法

设计：动物实验观察。

时间及地点：于2012年12月至2013年2月在扬州大学医学院中心实验室完成。

材料：

实验动物：健康成年SD大鼠2只(雌雄各1只)，体质量250-300 g，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)：2013-0019。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

方法：

嗅黏膜取材：SD大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉，消毒面部皮肤。在无菌条件下经一侧鼻孔沿鼻腔向上至内眦部剪开皮肤及鼻骨，暴露鼻中隔黏膜，用虹膜枪和眼科剪分离、剪取鼻中隔上1/3嗅黏膜。创面充分止血，缝合皮肤。

嗅鞘细胞的获取：嗅黏膜取出后，用DF12培养基漂洗3次去除血迹后移至0.25%胰酶中，用眼科剪充分剪碎，并用吸管吹打，制成嗅黏膜细胞悬液。用培养基终止消化，离心清洗去除胰酶。用DF12培养基培养，接种于无包被玻璃培养瓶，置培养箱内(37 ℃，体积分数5%CO₂)培养。 24 h后将培养基和悬浮的嗅鞘细胞吸出，重新接种于玻璃培养瓶培养，待细胞贴壁后，每3 d换液1次。每天观察细胞的生长情况, 数码相机照相。当细胞铺满瓶底时进行消化，传代。将细胞接种于铺有圆盖片的24孔培养板，用于免疫荧光染色。

体外培养细胞的免疫染色鉴定：接种于铺有圆盖片的24孔培养板的细胞，在弃去培养液后用PBS漂洗，在室温下用40 g/L多聚甲醛固定24 h。分别用 NGFRp75和GFAP抗体对培养细胞进行免疫荧光染色鉴定。

磺基罗丹明B(SRB)法观察嗅鞘细胞的生物活性：取对数生长期嗅鞘细胞，用DFl2培养液制成浓度为2×10⁷ L^-1的细胞悬液，加到96孔板，每孔200 µL，置于CO₂培养箱内(37 ℃，体积分数5%CO₂)培养24 h细胞贴壁后，吸去培养液，分别加入200 µL含不同体积分数胎牛血清的DF12培养液培养细胞(即0%组、10%组、20%组、30%组、40%组、50%组、60%组、70%组、80%组、90%组)，共计10组，每组设4个平行孔，再次置入CO₂培养箱内(37 ℃，体积分数5%CO₂)培养，于第1-21天后，隔天取细胞培养板检测。弃掉培养液，PBS冲洗一两次，每孔加入100 µL 10%TCA， 4 ℃固定1 h；弃掉TCA，去离子水冲洗3-5遍，干燥。每孔加入100 µL 0.2%磺基罗丹明B染液，室温下染色 30 min；弃掉染液，用1%醋酸洗掉未结合的染液，干燥。每孔加入200 µL pH 0.5的10 mmol/L非缓冲Tris碱液，置摇床低速振荡20 min。在酶标仪A₄₉₀波长下测量各孔的吸光值(A值)。

主要观察指标：大鼠嗅鞘细胞的形态学观察及免疫荧光鉴定；血清浓度对细胞生长影响的实验结果以及生长时间对细胞生长影响的实验结果。

统计学分析：数据用SPSS 13.0软件进行重复测定方差分析，统计软件来源于南方医科大学。

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讨论

成人脊髓损伤后神经再生困难是神经科学领域有待解决的难题，近年来嗅鞘细胞移植治疗中枢神经系统损伤的实验和临床研究结果为中枢神经系统损伤后的再生带来了希望^[11-12]，研究认为在损伤时神经纤维周围的一些胶质细胞能够产生一些抑制轴突再生因素如生长抑制蛋白等，嗅鞘细胞独特的成鞘作用可以使受伤神经纤维和周围胶质细胞微环境隔绝，从而有效保护新生轴突并为其生长提供适宜的微环境，引导再生轴突穿过疤痕阻碍向远端靶组织延伸^[13-14]。因此，嗅鞘细胞移植被认为是治疗脊髓损伤最有前景的方法之一，很多学者因此认为建立一种嗅鞘细胞的体外培养方法具有重要意义^[15-18]。

目前用于很多研究证实嗅鞘细胞多来源于嗅球，对嗅黏膜嗅鞘细胞的纯化培养方法以及生物学特性后期才逐渐增多^[19-22]。实验取材大鼠嗅区的嗅黏膜组织，采用嗅黏膜混合细胞培养，单纯经传代后以纯化^[23-25]。通过本实验作者再次证实了嗅黏膜来源的嗅鞘细胞的体外培养的可能性^[7]，形态学观察结果显示：嗅黏膜混合细胞经过数次传代后，扁平细胞逐渐凋亡消失，嗅鞘细胞成为优势细胞。嗅黏膜嗅鞘细胞的纯度随着培养时间的延长，传代次数的增加而不断增高。其结果令人非常满意，嗅鞘细胞的纯度可达到90%以上。培养的嗅黏膜细胞经传代后，细胞从形态来看主要有双极和三极细胞，胞体发亮，折光性好，突起细长，并相互连接成网。嗅鞘细胞标志蛋白NGFRp75^[26]，GFAP^[27]呈免疫反应阳性，也证实培养的细胞是嗅鞘细胞且纯度较高^[28-29]。

本实验进行了在不同血清浓度(0%，10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%)及不同生长时间(1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23 d)条件下，对体外培养大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞生长曲线的比较。结果为，血清浓度0%组对细胞生长有较强的抑制作用，表明嗅鞘细胞体外增殖培养对血清具有依赖性，这与作者前期实验结论一致^[7]。血清浓度10%，20%，30%，40%组对细胞增殖均有较强促进作用，在培养2周左右，这几组的培养液对嗅鞘细胞的促进作用尤为明显，细胞也生长迅速，随后进入一个平台期，但到了3周之后，细胞的增殖作用有减弱的趋势^[30-31]。血清浓度为50%，60%，70%，80%，90%组对细胞的增殖也有一定的促进作用，但这种促进作用较之前几组明显的减弱，随着时间的延长，到2周后，磺基罗丹明B法测定细胞的A值逐渐减小，表明这几组的培养液对嗅鞘细胞的促进作用已转变为抑制作用。

从这次实验结果中不难看出，血清浓度10%-40%组促进细胞增殖的作用比血清浓度50%-90%组的作用大，究其原因，作者认为可能的因素有：①嗅鞘细胞在生长发育过程中，不断产生代谢产物，随着DF12培养液中血清浓度的增多，生长迅速，进而代谢产物增多，其组成成分复杂，产物中的有害物质达到一定浓度时对嗅鞘细胞生长可能有抑制作用^[32-33]，导致血清浓度超过50%后促进作用反而减弱。②细胞的生长过程中需要酶的参与^[34-35]，嗅鞘细胞也不例外，此实验采用的是胰酶，每一种酶发挥最大活性时，都有其最适pH值。随着胎牛血清浓度的改变，其溶液的离子化程度有可能发生变化，影响其pH值^[36-37]。③胎牛血清制剂在生产过程中由于操作流程的不规范使其含有微量离子杂质，当其达到一定程度时，对细胞的生长有抑制作用也是很有可能的^[38-40]。

实验结果证明不同血清浓度及培养时间等体外培养环境对大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的生长和生存有明显影响，因此利用血清进行体外细胞培养时应充分考虑所添加血清的浓度以及细胞培养的时间，该实验为嗅鞘细胞体外培养提供最佳微环境条件，以及为进一步嗅鞘细胞抑制治疗脊髓损伤提供一定的参考和实验依据。

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